Экспресс-диагностика и профилактика туберкулезной инфекции в современных условиях промышленного молочного скотоводства
Лысенко А.П., доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий отделом молекулярной биологии РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского»
Статус стада официально свободного от туберкулеза - одно из условий экспорта молочных продуктов. Если в таком стаде, даже одна корова, дала неопределенную или положительную реакцию на туберкулин, государственная ветеринарная служба должна приостановить действие статуса благополучия и выяснить ее причину. Статус благополучия восстанавливается при получении убедительных доказательств отсутствия туберкулеза в стаде. Это достигается несколькими путями.
1. Всех животных с неопределенной и положительной реакцией на туберкулин подвергают убою. При отсутствии в органах и тканях специфических изменений отбирают патологический материал, который исследуют по ускоренной схеме (Сообщение I), позволяющей получить заключение через 1-10 дней или традиционными бактериологическими методами (продолжительность 90-120 суток).
2. После сдачи на убой животных с положительной реакцией и отсутствии у них признаков болезни через 42 дня стадо исследуют туберкулиновой пробой.
3. После сдачи на убой животных с положительной реакцией и отсутствии у них признаков болезни через 42 дня стадо исследуют симультанной пробой.
Статус благополучия восстанавливается при получении отрицательных результатов исследований.
В больших молочно-товарных комплексах (МТК) может выделяться много туберкулинпозитивных животных, у которых реакции связаны с инфицированием нетуберкулезными микобактериями (НТМБ). Убой таких животных необоснован. В этой связи, в рамках ВСП «Диагностика туберкулеза животных» (№ 46, 10.06.2010 г.) целесообразно проводить дифференциальную диагностику путем исследования крови реагирующих животных, которое позволяет выяснить этиологию реакций и принять адекватные профилактические меры.
Дифференциально диагностический комплекс разработан Институтом экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского и включает определение в крови:
уровня антител к антигенам микобактерий туберкулеза (МБТ, M.tuberculosis, M.bovis) и НТМБ (M.fortuitum) в иммуноферментном анализе (ИФА);
антигенов МБТ и их комплексов с антителами в ИФА;
ДНК микобактерий в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами 16 sRNA и МРВ 70 M.tuberculosis-M.bovis.
При выявлении большого числа реагирующих на туберкулин коров целесообразно дополнительно проводить посев крови, инкубированной в стимуляторе роста на питательную среду «Микофаст» (Myccel DW).
Продолжительность исследования крови в ИФА и в ПЦР – 1 день, при посеве крови – 6-7 суток.
Для оценки эффективности диагностического комплекса исследовали стерильно отобранные в одноразовые шприцы 349 проб крови коров 13 МТК, где выявлялись коровы с реакциями на туберкулин, а результаты бактериологического исследования патологического материала и биопробы были отрицательными.
Для ИФА использовали «Набор реагентов для определения специфичности антимикобактериальных антител» и «Набор реагентов для определения микобактериальных антигенов и их комплексов с антителами».
ПЦР ставили с праймерами M.tuberculosis-M.bovis 16 sRNA (543 bp) и МРВ 70 (472 bp) по стандартному протоколу [2].
Посев проб крови проводили на питательную среду Микофаст (Myccel DW). после инкубации в стимуляторе роста с 0,1% хлоргексидина [1,4].
Изоляты и мазки-отпечатки лимфатических узлов коров, убитых с диагностической целью, исследовали с помощью тест-системы для прямого выявления возбудителя туберкулеза [4].
Что же показали результаты проведенных исследований? Оказалось, что высокий уровень антител к МБТ (S/P) был обнаружен, в среднем у 88,9% туберкулинпозитивных коров (табл.1). При оценке специфичности антител установлено, что в 8 стадах 45-100% проб крови коров интенсивнее реагировали на M. bovis,чем на M. fortuitum, что указывало на высокую вероятность инфицирования животных МБТ. В 5 стадах (38,5%) этот показатель был в пределах 18-34%, что свидетельствовало о том, что у части животных реакции могли быть связаны с инфицированием НТМБ.
Сравнение интенсивности реакций на антигены M.tuberculosis и M.bovis показало, что пробы крови коров 12 стад (92,3%) чаще (в 52,4-100% случаях) интенсивнее реагировали с антигеном M. bovis. Но в стаде «О-ц» 64,7% проб дали выраженные реакции с M.tuberculosis. Это не было случайностью, при рекомендованном нами углубленном медицинском осмотре животноводов, был выявлен источник инфекции - сторож, больной туберкулезом. Кроме того, в 5 стадах до 45,8% коров также давали интенсивные реакции на антиген M.tuberculosis, при этом, на МТК «М-и» также был обнаружен животновод, больной туберкулезом.
Наличие в крови микобактериальных антигенов и их комплексов с антителами - важный показатель туберкулезной инфекции в стаде. Считается, что только МБТ, но не НТМБ, размножаются в организме хозяина и в крови могут появляться свободные и связанные с антителами антигены МБТ [3]. В обследованных стадах положительные результаты теста были получены у 57,3% туберкулинпозитивных коров, причем в 4 стадах, этот показатель превышал 80%.
Количество животных с высоким уровнем микобактериальных антигенов в крови коррелировало с интенсивностью реакций на M.tuberculosis и M.bovis. В стадах, где туберкулинпозитивные коровы интенсивнее реагировали на M.tuberculosis, только у 22,9-37,5% особей был повышен уровень антигенов МБТ. В стадах, где превалировали реакции на M.bovis, до 100 проб давали положительный результат теста.
В целом, результаты ИФА указывали на то, что основной причиной реакций на туберкулин, было инфицирование коров M.bovis, а в ряде случаев - M.tuberculosis. Это было подтверждено в ПЦР. С праймерами 16 sRNA (наличие в крови микобактериальной ДНК) реагировало до 100% пулов крови из 3-4 проб (см. вкладку рис. 1), причем 12,5% пулов, давали ПЦР с праймерами МРВ 70 M.tuberculosis-M.bovis (см. вкладку рис.2), что однозначно указывало на туберкулезную инфекцию в стаде.
При посеве проб крови на среду Микофаст в 25-94,1% случаев получен рост измененных формы МБТ (см. вкладку рис.3), нередко, трансформировашихся в типичные рубиново-красные палочки (см. вкладку рис.4).
Необходимо отметить, что на убое туберкулинпозитивных коров видимых туберкулезных изменений не обнаруживали, а рутинное бактериологического исследование давало отрицательные результаты. Только применение специальной питательной среды Микофаст со стимулятором роста позволило выделить микобактерии туберкулеза с измененной клеточной стенкой (CWD –cell wall deficient), которые существенно отличаются от типичных МБТ по морфологии, ряду свойств и отсутствию кислотоустойчивости. Такие CWD МБТ способны длительно персистировать в организме, не вызывая прогрессирующее заболевание, но при снижении резистентности могут вызывать развитие активного заболевания (риск 8-10%, от числа инфицированных). То есть, полученные результаты показали, что на МТК может при внешнем благополучии иметь место скрытая (латентная) туберкулезная инфекция.
Положительным моментом ИФА-диагностики можно считать возможность сохранения (до 50 %) туберкулинпозитивных коров с отрицательным тестом на антигены МБТ и с более интенсивной реакцией на антигены НТМБ. Наблюдение показало, что реакции на туберкулин у особей с такими показателями, выпадают в течение 2-4 месяцев.
Необходимо отметить, что кровь коров, реагирующая в ИФА, могла давать отрицательные результаты ПЦР. Это связано с ограничением чувствительности ПЦР с цельной кровью из-за присутствия в ней ингибиторов. Кроме того, в крови чаще находятся трансформированные CWD МБТ, которые из-за мутаций, могут не давать реакции с праймерами МРВ 70, МРТ 64, IS 6110 [2,5]. Поэтому, ИФА и ПЦР надо применять комплексно: ИФА – как тест, выявляющий инфицированных, а ПЦР, как подтверждающий. Причем, если даже одна туберкулинпозитивная корова дала положительную ПЦР, то этот результат должен распространяться на всех реагирующих, совместно содержащихся животных.
Необходимо отметить, что 2-3 летнее удаление из стад коров с положительными результатами ИФА и ПЦР обеспечили сохранение благополучия стад и привели к 3-4 кратному уменьшению выявления коров с реакциями на туберкулин.
Какие же условия способствуют возникновению и сохранению латентной туберкулезной инфекция в МТК?
Наиболее вероятно это:
1.Нарушения условий комплектования МТК.
МТК должны комплектоваться идентифицированными животными из стад, в которых при двух исследованиях с интервалом в 6 месяцев не было реагирующих на туберкулин особей.
2. Телки и нетели для комплектации стад проверяются только туберкулиновой пробой. Однако у животных этих поло-возрастных групп, обычно, бывает низкая чувствительность к туберкулину, поэтому инфицированные особи могут остаться не выявленными.
3. Отсутствие или формальная идентификация, поэтому на ремонт стада могут попасть телята туберкулинпозитивных коров.
4.Формальное медицинское обследование животноводов. На работу с животными попадают лица с не выявленным заболеванием, не закончившие лечение от туберкулеза.
5. Привлечение к обслуживанию животных лиц, отбывающих наказание, использование для работ по благоустройству МТК лиц из центров занятости, без определенного места жительства, доступность территории для посещения посторонними лицами.
Как показали наши исследования, инфицированность животноводов МБТ влияет на возникновение реакций на туберкулин у коров. Возбудитель туберкулеза человеческого вида не вызывает у коров туберкулезных изменений, но индуцирует реакции на туберкулин [8].
6. На МТК не проводится регулярной санации и дезинфекции помещений с использованием современных низкотоксичных дезинфектантов, эффективных в отношении возбудителей туберкулеза.
Применение традиционно использующегося горячего 3% щелочного раствора формальдегида для дезинфекции на МТК затруднено, особенного в зимний период, кроме того после его применения необходима мойка поверхностей.
7. Проекты МТК и технологии не проходят ветеринарно-санитарной экспертизы, поэтому допускаются решения, способствующие распространению инфекции:
- отсутствие помещений для карантинирования и изоляции;
- отсутствие условий для ветеринарных обработок (особенно в зимний период);
- малое количество поилок, использование поилок типа сообщающихся сосудов с большим объемом воды;
- отсутствие технических возможностей санитарной обработки поилок (возбудитель с истечениями из носа и рта долго сохраняются в воде и легко передается другим животным);
- дача концентратов на линии на дойке (все стадо «лижет» одни кормушки);
- перегон групп животных из секции в секцию;
- создание общих групп сухостойных коров из разных секций с возвратом в исходную группу после отела (допустимо, если в группах не было реагирующих животных при 2 проверках с интервалом 6 месяцев).
В целом, для обеспечения устойчивого благополучия и снижения инфицированности коров необходимо:
1. Усилить контроль комплектации МТК государственной ветеринарной службой, исключить влияния руководителей разного уровня на этот процесс.
2. Закрепить нормативным актом обязательность комплектации МТК комиссионно с обследованием животных туберкулиновой пробой, в ИФА и в ПЦР и путем посева крови на специальные питательные среды. На наш взгляд, это на 80-100% снизит риск попадания инфицированных животных на МТК.
3. Ввести обязательную ветеринарно-санитарную экспертизу проектов МТК и крупных МТФ, а также запланированных для них технологий.
4. Включить в алгоритм медицинского осмотра животноводов исследование крови в ИФА на наличие специфических антител и антигенов для раннего выявления активации инфекции, так как флюорография выявляет только явно больных лиц со сроком активного заболевания более 6-12 месяцев.
5. Лиц, отбывающих наказание, допускать к работе по обслуживанию МТК только после прохождения углубленного медосмотра (флюорография, ИФА на наличие в крови специфических антител и антигенов, микроскопия и ПЦР мокроты, посев мочи).
6. Увеличить закупку и использование производимых в республике низкотоксичных дезинфектантов с моющими свойствами, а также порошковидных (для постоянной подсыпки) эффективных в отношении микобактерий туберкулеза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Архипов И.Н. Серологические, бактериологические и молекулярно-генетические маркеры туберкулезной инфекции крупного рогатого скота: Автореф. дисс. … канд. вет. н.- Минск 2011.- 21с.
2. Лемиш А.П. Ранняя диагностика туберкулеза крупного рогатого скота на основе выявления бактериологического маркера инфекции: Автореф. дисс. … канд. вет. н. - Минск.- 2008.- 21с.
3. Лысенко А.П., Агеева Т.Н., Карпова Г.А. Исследование сыворотки крови здоровых коров, больных туберкулезом и инфицированных атипичными микобактериями в перекрестном иммуноэлектрофорезе и иммуноферментном анализе // Ветеринарная наука - производству. Научные труды. – 1998.- вып.33. -с.37-47.
4. Лысенко А.П., Власенко В.В., Broxmeyer L., Лемиш А.П., Новик Т.П., Букова Н.К., Михалевич Е.А., Богданович С.В. Феномен изменчивости микобактерий туберкулеза и его использование для обнаружения туберкулезной инфекции// Туберкулез -глобальная катастрофа человечества. Материалы I Международной заочной научно-практической конференции 24 марта 2014 г. Ростов-на-Дону 2014.- с.176-198.
5. Мельникова Н.Н. Бактериологическая диагностики туберкулеза внелегочных локализаций с исследованием L-трансформированных вариантов микобактерий: Автореф.дис. …канд. мед. н. -Санкт – Петербург.- 2007.-20 с.
6. Яковлева Л.Ф., Лысенко А.П., Лемиш А.П. с соавт. Реакции на туберкулин у коров и иммунный ответ на антигены возбудителя туберкулеза у животноводов //Проблемы туберкулеза и болезней легких.- 2008.-3.- с. 20-23.
Рис. 1 – Амплификаты ДНК из пулов крови туберкулинпозитивных коров МТК «Г-ы». ПЦР с праймерами 16 sRNA M.tuberculosis-M.bovis. Стрелкой показано положение амплификата 543 bp 16 sRNA
Рис. 2 – Амплификаты ДНК из пулов крови пулов крови туберкулинпозитивных коров МТК «Г-ы». ПЦР с праймерами МРВ 70 M.tuberculosis-M.bovis. Белыми стрелками показано положение амплификата 472 bp МРВ 70
Рис. 3 - Рост в посеве крови ПЦР+ коровы № 28484 МТК ОАО Б-и на среде Микофаст. Видны окрашенные в коричневый цвет палочки. ДИП окраскаконъюгатом ПХ-Ig M.bovis - Kinyoun (10х100)
Рис. 4 - Рост в посеве крови ПЦР+ коровы № 60543 МТК К-и на среде Микофаст. Видны 2 рубиново-красные палочки (стрелки) в сетевидной структуре. ИП окраска ПХ-Ig M.bovis - Kinyoun (10х100)